熒光偏振：生命科學(xué)研究領(lǐng)域的新寵兒

   “熒光偏振”。近年來(lái)，以這種物理學(xué)現(xiàn)象為基礎(chǔ)的技術(shù)正悄悄地在生命科學(xué)研究的多個(gè)領(lǐng)域中扮演著越來(lái)越重要的角色。
    以熒光偏振為基礎(chǔ)發(fā)展的技術(shù)可用來(lái)研究生命科學(xué)中分子之間的相互作用，以及分子與所處環(huán)境——“小”至核酸和蛋白結(jié)構(gòu)，“大”至整個(gè)細(xì)胞——的相互作用。相對(duì)于傳統(tǒng)研究方法，熒光偏振技術(shù)在溶液中進(jìn)行，可*大程度的模擬真實(shí)生命環(huán)境；利用它，可以實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)分子間結(jié)合/分離的變化，并解決一直以來(lái)困擾熒光技術(shù)使用者們對(duì)于熒光無(wú)法定量的煩惱。*為重要的是，相對(duì)于一直被人們使用的放射性同位素研究方法，它更為**可靠，不會(huì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)研究者造成威脅，也不會(huì)產(chǎn)生難以處理的具有放射性的廢棄物。此外，熒光偏振所需的樣品量少，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。

理論基礎(chǔ)
　　談起熒光偏振，可能需要從偏振光開始。光由微小的波構(gòu)成，光波可以在任何一個(gè)平面上均勻的振動(dòng)。當(dāng)其通過(guò)某些平面時(shí)，有可能因受到平面的作用將光波的能量分成不均勻的光束，振動(dòng)平面也就發(fā)生了變化，可能在某一個(gè)方向的振動(dòng)強(qiáng)或弱于其他平面，這種光稱為偏振光?；瘜W(xué)研究中常用到偏振光理論，這是因?yàn)槠窆庠谕ㄟ^(guò)含有某種分子的溶液時(shí)，其振動(dòng)性質(zhì)將發(fā)生改變，如偏振平面受到扭轉(zhuǎn)，根據(jù)扭轉(zhuǎn)的方向和角度的變化，就能夠?qū)θ芤褐蟹肿拥慕Y(jié)構(gòu)作出推斷。現(xiàn)在，將偏振光和生物學(xué)研究者的得力助手“熒光分子”相結(jié)合形成的熒光偏振理論，正在生物學(xué)分支學(xué)科理論和應(yīng)用研究中大顯身手。
　　熒光偏振應(yīng)用的基礎(chǔ)——“熒光偏振理論”也是物理課上的老話題。1926年Perrin**在研究論文中描述他所觀察到的熒光偏振現(xiàn)象。他發(fā)現(xiàn)，以一束單一波長(zhǎng)的偏振光照射溶液中的熒光物質(zhì)，后者可吸收并釋放出相應(yīng)的偏振熒光。如果被激發(fā)的熒光物質(zhì)處于靜止?fàn)顟B(tài)，該物質(zhì)仍將保持原有激發(fā)光的偏振性；如果其處于運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，該物質(zhì)發(fā)出的偏振光將區(qū)別于原有激發(fā)光的偏振特性，也就是所謂的熒光去偏振現(xiàn)象。
　　眾所周知，任何物質(zhì)都處于不斷運(yùn)動(dòng)當(dāng)中，液態(tài)環(huán)境中的熒光分子也不例外。因此當(dāng)受到偏振光激發(fā)時(shí)，熒光分子的運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，例如旋轉(zhuǎn)或翻轉(zhuǎn)；熒光分子與其它因子的相互作用，例如相互結(jié)合或排斥；其所處環(huán)境的性質(zhì)，例如溶液的粘度、溫度等，這些因素都有可能對(duì)這個(gè)熒光因子受激發(fā)后發(fā)出的偏振光的性質(zhì)產(chǎn)生影響。對(duì)此進(jìn)行分析比較，有可能揭開物質(zhì)活動(dòng)的內(nèi)在規(guī)律，達(dá)到研究目的。
　　因此，我們可以看到，以熒光偏振為基礎(chǔ)發(fā)展的技術(shù)可用來(lái)研究生命科學(xué)中分子之間的相互作用，以及分子與所處環(huán)境——“小”至核酸和蛋白結(jié)構(gòu)，“大”至整個(gè)細(xì)胞——的相互作用。相對(duì)于傳統(tǒng)研究方法，熒光偏振技術(shù)在溶液中進(jìn)行，可*大程度的模擬真實(shí)生命環(huán)境；利用它，可以實(shí)時(shí)跟蹤監(jiān)測(cè)分子間結(jié)合/分離的變化，并解決一直以來(lái)困擾熒光技術(shù)使用者們對(duì)于熒光無(wú)法定量的煩惱。*為重要的是，相對(duì)于一直被人們使用的放射性同位素研究方法，它更為**可靠，不會(huì)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)研究者造成威脅，也不會(huì)產(chǎn)生難以處理的具有放射性的廢棄物。此外，熒光偏振所需的樣品量少，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。在以下的應(yīng)用介紹中，讀者將會(huì)看到這項(xiàng)技術(shù)優(yōu)越性的顯著體現(xiàn)。
 
　　應(yīng)用概述臨床應(yīng)用方面
　　熒光偏振**技術(shù)（Fluorescence Polarization Immunassay）——這是一項(xiàng)相對(duì)較為成熟的技術(shù)。它利用熒光偏振原理，采用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合法機(jī)制，常用來(lái)監(jiān)測(cè)小分子物質(zhì)如**、**在樣本中的含量。以**檢測(cè)為例，以熒光素標(biāo)記的**和含待測(cè)**的樣本為抗原，與一定量的抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。熒光標(biāo)記的**在環(huán)境中旋轉(zhuǎn)時(shí)，偏振熒光的強(qiáng)度與其受激發(fā)時(shí)分子轉(zhuǎn)動(dòng)的速度成反比。大分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)慢，發(fā)出的偏振熒光強(qiáng)；小分子物質(zhì)旋轉(zhuǎn)快，其偏振熒光弱（去偏振現(xiàn)象）。因此，在競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合過(guò)程中，樣本中待測(cè)**越多，與抗體結(jié)合的標(biāo)志抗原就越少，抗原抗體復(fù)合物體積越大，旋轉(zhuǎn)速率越慢，從而激發(fā)的熒光偏振光度也就越少。當(dāng)我們知道了已知濃度的標(biāo)記抗原與熒光偏振光性的關(guān)系后就可以測(cè)量未知濃度的物質(zhì)。因此，這項(xiàng)技術(shù)可用來(lái)檢測(cè)環(huán)境或食品樣品中有毒物質(zhì)如農(nóng)藥的殘留量。
　　此外，臨床醫(yī)學(xué)診斷也在廣泛采用熒光偏振。除應(yīng)用上述方法可測(cè)定人體體液樣本中某一特定物質(zhì)的含量外，也可直接應(yīng)用于臨床診斷。例如，由Cercek等開發(fā)的惡性腫瘤診斷方法中提出，進(jìn)入**細(xì)胞的熒光物質(zhì)，受胞漿濃度有序性的干擾，其運(yùn)動(dòng)方向和速率會(huì)發(fā)生變化。胞漿粘度高時(shí)，熒光物質(zhì)運(yùn)動(dòng)變慢，受偏振光激發(fā)產(chǎn)生的激發(fā)光與胞漿粘度低時(shí)產(chǎn)生的激發(fā)光性質(zhì)不同。通過(guò)追蹤測(cè)定激發(fā)的偏振光性質(zhì)，即可了解**細(xì)胞的胞漿流動(dòng)性、粘度等環(huán)境的變化，結(jié)合其它輔助診斷方法，可有助于癌癥的早期診斷。利用熒光偏振，還可檢測(cè)病人樣本中病毒DNA如HBV、HPV的復(fù)制量，為臨床診斷提供有力的量化指標(biāo)依據(jù)。
 
科研方面
　　從熒光偏振的理論基礎(chǔ)可以看出，它特別適用于研究分子之間的相互作用關(guān)系，因此，越來(lái)越多的研究者開始尋找以熒光偏振為基礎(chǔ)的研究方法來(lái)解決技術(shù)難題。目前，熒光偏振在生物學(xué)研究的應(yīng)用主要有以下幾個(gè)方面：
 
核酸結(jié)構(gòu)變化研究
　　利用熒光偏振可幫助揭開DNA結(jié)構(gòu)和結(jié)合蛋白之間的作用關(guān)系。以2003年Nucleic Acids Research發(fā)表的一篇文章為例：DNA的復(fù)制、重組、修復(fù)，RNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯和后處理等過(guò)程都涉及到核酸單鏈、雙鏈結(jié)構(gòu)的變化。解旋酶（Helicase）是雙鏈DNA解鏈的動(dòng)力蛋白，它以單向運(yùn)動(dòng)在DNA雙鏈上變換位置和核苷酸相結(jié)合，通過(guò)DNA上核苷5’三磷酸獲得ATP能量水解雙鏈DNA配對(duì)堿基間的H鍵。研究發(fā)現(xiàn)，以熒光標(biāo)記寡核苷酸，后者可高度自由旋轉(zhuǎn)，因此受到偏振光的激發(fā)后發(fā)出的激發(fā)光偏振性很低。解旋酶-寡核苷酸復(fù)合物分子量大，旋轉(zhuǎn)速度低，激發(fā)光的偏振性高。隨著復(fù)合物的解體，高的偏振信號(hào)急劇減弱。因此，這種方法可結(jié)合動(dòng)力學(xué)研究，通過(guò)偏振信號(hào)的變化對(duì)DNA雙鏈形成和解鏈過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，靈敏度高，方便迅速。此外，這種方法也應(yīng)用于其它蛋白與DNA結(jié)合的研究中。
 
蛋白激酶活性研究
　　人體細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶可以對(duì)細(xì)胞外調(diào)節(jié)因子和環(huán)境變化做出反應(yīng)，使細(xì)胞活化、生長(zhǎng)和分化，轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、**應(yīng)答等的重要調(diào)節(jié)因子。人們普遍認(rèn)為蛋白激酶的錯(cuò)誤表達(dá)和功能發(fā)揮失常是造**類多種**的原因。因此，長(zhǎng)期以來(lái)，研究者致力于蛋白激酶結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理的研究，生物制藥業(yè)更是將蛋白激酶和蛋白激酶抑制劑作為小分子**研究的熱點(diǎn)。
　　Panvera開發(fā)了一種基于熒光偏振的蛋白激酶活性試劑盒，可方便快捷的進(jìn)行蛋白激酶抑制因子和篩選工作。其工作原理如下：將磷酸化底物進(jìn)行熒光標(biāo)記，與由蛋白激酶產(chǎn)生的未標(biāo)記磷酸化產(chǎn)物抗絲氨酸抗體相競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合。當(dāng)反應(yīng)液中沒有蛋白激酶產(chǎn)生的磷酸化產(chǎn)物時(shí)，熒光標(biāo)記物與抗體相結(jié)合，因復(fù)合物體積較大，運(yùn)動(dòng)速率較小，受偏振光激發(fā)后產(chǎn)生的激發(fā)光具有較大的偏振值；當(dāng)反應(yīng)液中含有蛋白激酶產(chǎn)生的磷酸化產(chǎn)物時(shí)，因二者競(jìng)爭(zhēng)抗體的結(jié)合位點(diǎn)，較少的熒光標(biāo)記物結(jié)合到抗體上去，自由的熒光標(biāo)記物在反應(yīng)液中增多，發(fā)出的激發(fā)光偏振值減小。因?yàn)榈鞍准っ傅幕钚栽酱?，產(chǎn)生的磷酸化產(chǎn)物越多，與熒光標(biāo)記物的競(jìng)爭(zhēng)越激烈，對(duì)標(biāo)記物產(chǎn)生的激發(fā)光的性質(zhì)影響越大，因此偏振的改變直接與蛋白激酶的活性相關(guān)。這種分析簡(jiǎn)單，易于應(yīng)用，可很好的適用于高通量的篩選工作。
 
SNPs篩選
　　SNPs是指人類基因組中普遍存在的個(gè)體之間相互區(qū)別的堿基變化位點(diǎn)，稱作單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms）。人們普遍認(rèn)為，SNPs是人類個(gè)體之間相互區(qū)別的原因，也和多種**發(fā)生、變化相聯(lián)系。長(zhǎng)期以來(lái)，SNPs位點(diǎn)的快速篩選需要大量的基因分型工作，花費(fèi)巨大，是工作進(jìn)展的*大障礙。現(xiàn)在，研究者可以采用熒光偏振為基礎(chǔ)的FP-TDI技術(shù)（fluorescence polarization template-directed dye-terminator incorporation）進(jìn)行高通量單核苷酸多態(tài)分型，操作簡(jiǎn)單，投入少。
　　實(shí)驗(yàn)過(guò)程中先通過(guò)PCR獲得含有SNP位點(diǎn)的一條擴(kuò)增產(chǎn)物，針對(duì)這條含有SNP興趣位點(diǎn)的序列設(shè)計(jì)一條寡核苷酸探針，在DNA聚合酶和熒光標(biāo)記的ddNTP存在下，探針單堿基延伸。特定的ddNTP將結(jié)合到靶序列的SNP位點(diǎn)，并造成延伸反應(yīng)的終止。自由的標(biāo)記有熒光的ddNTP比結(jié)合到靶序列的ddNTP體積小，在液體環(huán)境中旋轉(zhuǎn)速度快，激發(fā)的偏振光的偏振值也小，而后者當(dāng)ddNTP加到序列上后，有效分子體積變大，受偏振光激發(fā)后發(fā)出的偏振值高。因此，熒光偏振現(xiàn)象可以應(yīng)用在鑒別ddNTP的結(jié)合位點(diǎn)和基因分型。
　　目前，熒光偏振技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用并不局限于以上幾個(gè)方面，以熒光偏振為基礎(chǔ)已經(jīng)衍生出多項(xiàng)相關(guān)技術(shù)。受篇幅所限，本文只是將熒光偏振在目前研究領(lǐng)域中熱門方向中的應(yīng)用和原理作了一個(gè)簡(jiǎn)單的介紹。相信隨著學(xué)科間的不斷交叉、融合和這項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)化與推廣，它將受到研究者越來(lái)越廣泛的關(guān)注，在更多的研究領(lǐng)域發(fā)揮其重要作用。■