雙光子共聚焦顯微鏡

激光共聚焦顯微鏡在進行生物樣品研究工作中還存在很多局限和問題：
一是標記染料的光漂白現(xiàn)象。因為共焦孔徑光闌必須足夠小以獲得高分辨率的圖像，而孔徑小又會擋掉很大部分從樣品發(fā)出的熒光，包括從焦平面發(fā)出的熒光，相應的，激發(fā)光必須足夠強以獲得足夠的信噪比；而高強度的激光會使熒光染料在連續(xù)掃描過程中迅速褪色，熒光信號會隨著掃描進程度進行變得越來越弱。
光毒作用是另外一個問題，在激光照射下，許多熒光染料分子會產(chǎn)生諸如單態(tài)氧或自由基等細胞**，所以實驗中要限制掃描時間和激發(fā)光的光功率密度以保持樣品的活性。在針對活性樣品的研究中，尤其是活性樣品生長、發(fā)育過程的各個階段，光漂白和光毒現(xiàn)象使這些研究受到很大的限制。
 在傳統(tǒng)熒光顯微鏡中，一個熒光團吸收一個光子，該光子能量對應于熒光團基態(tài)和激發(fā)態(tài)能量之差。通過一個較短壽命的虛態(tài)，也可以通過同時吸收兩個較低能量（即更高的波長）的光子激發(fā)熒光。例如，吸收兩個紅色波長的光子，可以激發(fā)一個吸收紫外的分子。雙光子激發(fā)是一個非線性過程，對激發(fā)光強度有平方依賴關(guān)系。
使用單激發(fā)光源，雙光子具有相同的波長，該技術(shù)被稱為雙光子激發(fā)熒光顯微術(shù)。如果兩個光子具有不同的波長，就稱作雙色激發(fā)熒光顯微術(shù)。
雙光子吸收幾率依賴于兩個入射光子在空間和時間上的重合程度（兩個光子必須在10－18秒內(nèi)到達）。雙光子吸收截面很小，對若丹明B一般為10－50cm4 s photon－1 molecule－1，這樣，只有在具有很大光子流量的區(qū)域的熒光團才會被激發(fā)。鈦寶石激光器等鎖模的，高峰值功率激光可以為雙光子激發(fā)提供足夠的強度。
由于激發(fā)強度隨到焦平面的距離的平方變化，在z軸方向雙光子激發(fā)幾率隨離焦距離的四次方衰減，熒光團激發(fā)只發(fā)生在焦點內(nèi)。用數(shù)值孔徑為1.25的物鏡，激發(fā)波長為780納米，全部激發(fā)熒光的80%被局限在焦平面1微米范圍內(nèi)，激發(fā)體積大約為0.1-1飛升，與傳統(tǒng)熒光顯微鏡相比，該體積降低了1010倍。
在激光掃描熒光顯微術(shù)中，雙光子激發(fā)具有三維層析能力，該三維層析效果可與共焦顯微鏡相比擬，它還比具有另外兩個優(yōu)勢：因為照明光在時間空間上匯聚，沒有離焦光漂白；激發(fā)光不會被離焦吸收衰減，因而有較大的穿透深度。
雙色激發(fā)比雙光子激發(fā)的優(yōu)勢并不在于較高的分辨率，而是在于小目標物經(jīng)過較大散射媒質(zhì)后更容易觀察。事實上，與雙光子激發(fā)比較，雙色激發(fā)在焦點內(nèi)熒光散射增加，而干擾背景熒光只有很小增加。
    結(jié)合多光子熒光技術(shù)，多光子共聚焦顯微鏡（Multiphoton Excitation－MPE）的發(fā)展成功的解決了傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡（單光子共聚焦顯微鏡）所存在的問題，MPE的激光源是超快激光器（多為鈦寶石激光器，可以達到皮秒或者飛秒級的掃描速度），具有非常高的峰值功率和較低的平均功率，從而可以減小或者消除光漂白和光毒作用。多光子的吸收現(xiàn)象是非線性效應，只發(fā)生在聚焦焦點處，不需要共聚焦孔徑光闌濾光，從而大大提高成像亮度和信噪比。在傳統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡中，光通過出的所有樣品都被激發(fā)，所以必須用孔徑光闌來選取焦點處樣品發(fā)出的熒光。孔徑光闌不僅遮擋了焦點以外樣品發(fā)出的熒光，而且也遮擋了焦點處散射和漫反射的熒光。在MPE中，焦點處發(fā)出的所有熒光，包括散射和漫反射的熒光都可以被收集并探測到。并且由于多光子實驗所用的激發(fā)光的波長較長，激發(fā)光的散射損失很小，軸向分辨率更高，樣品的穿透能力更強。