激光掃描共焦顯微鏡特點及其應用

激光掃描共焦顯微鏡(Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM)是上世紀80年代開始投入實際應用的一種顯微設備。與普通光學顯微鏡相比，LSCM具有更高的分辨率和放大倍率，并可以對觀測樣品進行分層掃描，實現樣品的三維重建和測量分析; 與電子顯微鏡相比，LSCM可以在亞細胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值和膜電位等生理信號及活細胞形態(tài)的實時動態(tài)變化。因此，這項產品的面世是顯微成像技術發(fā)展史中具有劃時代意義的重大進展。LSCM在形態(tài)學、分子細胞生物學、神經學、藥理學、遺傳學等生物醫(yī)學領域，以及材料學、地質學、水利學等工業(yè)工程領域有著廣泛的應用。根據應用方向的不同，可分為生物用激光掃描共焦顯微鏡和工業(yè)用激光掃描共焦顯微鏡。

一.LSCM的基本原理及結構特點

    普通光學顯微鏡使用的鹵素燈光源為混合光，光譜范圍寬，成像時樣品上每個照光點均會受到色差影響以及由照射光引起的散射和衍射的干擾，影響成像質量。而LSCM結構上采用精密共焦空間濾波，形成物象共軛的獨特設計，激光經物鏡焦平面上針孔形成點光源對樣品掃描，于測量透鏡焦平面的探測針孔處經空間濾波后，有效地抑制同焦平面上非測量光點形成的雜散熒光和樣品不同焦平面發(fā)射來的干擾熒光。這是因為光學系統(tǒng)物象共軛，只有物鏡焦平面上的點經針孔空間濾波才能形成光點圖像，掃描后可得到信噪比極高的光學斷層圖像，分辨率比普通光學顯微鏡提高1.4倍。LSCM的光源為激光，單色性好，基本消色差，成像聚焦后焦深小，縱向分辨率高，可無損傷地對樣品作不同深度的層掃描和熒光強度測量，不同焦平面的光學切片經三維重建后能得到樣品的三維立體結構，這種功能被形象地稱為“顯微CT”。

    LSCM由顯微鏡光學系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測系統(tǒng)構成，整套儀器由計算機控制，各部件之間的操作切換都可在計算機操作平臺界面中方便靈活地進行。顯微鏡是LSCM的主要組件，它關系到系統(tǒng)的成像質量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在活細胞檢測等生物醫(yī)學應用中使用更廣泛。

    二.LSCM的生物醫(yī)學應用

    LSCM的高靈敏度、高分辨率、高放大倍數，提供了光學顯微鏡無法顯示的結構，使細胞生物學研究上了一個臺階。目前我們可以在亞細胞水平進行動態(tài)實驗，檢測細胞生物質和離子通道的變化，觀察細胞在生理、病理和藥理情況下對外界因素作用所產生的快速反應，進行定性、定量、定時和定位的分析測量。*常用的功能是細胞三維重建、細胞熒光檢測等。
    1. 細胞的三維重建
    普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖像結構為多層面的圖像疊加，結構不夠清晰。LSCM能以0.1μm的步距沿軸向對細胞進行分層掃描，得到一組光學切片，經A/D轉換后作為二維數組貯存。這些數組通過計算機進行不同的三維重建算法，可作單色或雙**像處理，組合成細胞真實的三維結構。旋轉不同角度可觀察各側面的表面形態(tài)，也可從不同的斷面觀察細胞內部結構，測量細胞的長寬高、體積和斷層面積等形態(tài)學參數。通過模擬熒光處理算法，可以產生在不同照明角度形成的陰影效果，突出立體感。通過角度旋轉和細胞位置變化可產生三維動畫效果。LSCM的三維重建廣泛用于各類細胞骨架和形態(tài)學分析、染色體分析、細胞程序化死亡的觀察、細胞內細胞質和細胞器的結構變化的分析和探測等方面。
    2. 細胞定量熒光測定
    顯微熒光光度計由于顯微鏡和激發(fā)光源的限制成像模糊，只能測定細胞內的熒光總量，有一定的誤差。LSCM以激光為光源，對細胞分層掃描，單獨測定，經積分后能得到細胞熒光的準確定量，重復性**。它適于活細胞的定量分析，可測定細胞內溶酶體、線粒體、DNA含量、RNA含量、酶和結構性蛋白質等物質含量和分布，常用于原位分子雜交、腫瘤細胞識別、單個活細胞水平的DNA損傷及修復的定量分析。它適于快速高靈敏度測量，減少光猝滅的影響，在定量**熒光測定方面應用廣泛，如作各種腫瘤組織切片抗原表達的定量分析，監(jiān)測腫瘤相關抗原表達的定位定量信息，監(jiān)測**對肌體**功能的作用，監(jiān)測自身**性**的多種抗原及**對肌體**功能的作用，監(jiān)測細胞結合和殺傷的形態(tài)特征并作定量分析等。細胞定量熒光測定可選用單熒光、雙熒光方式，能自動測定細胞面積、平均熒光強度、積分熒光強度及形狀因子等多種參數。
    3. 細胞內鈣離子pH值和其它離子的動態(tài)分析
    通過一些專用熒光探針，可對細胞內鈣離子、鈉離子及pH值等作熒光標記，并對它們進行比率值和濃度梯度變化測定。由于細胞內鈣離子為傳遞信息的**信使，對細胞生長分化起著重要作用，通過單標記或雙標記對細胞內鈣離子和其它離子的熒光強度和分布**測定，測定樣品達到毫秒級的快速變化。借助光學切片功能可以測量樣品深層的熒光分布以及細胞光學切片的生物化學特性的變化。通過不同時間段的檢測可測定細胞內離子的擴散速率，了解它對腫瘤啟動因子、生長因子等刺激的反應。細胞內離子測量廣泛用于腫瘤研究、組織胚胎學、細胞生物學和藥理學等領域。
    4. 細胞胞間通信和膜的流動性
    動物和植物細胞中縫隙連接介導的胞間通信在*******中起著重要作用。通過測量細胞縫隙連接分子的轉移，可以研究腫瘤啟動因子和生長因子對縫隙連接介導的胞間通信的抑制作用及細胞內鈣離子、pH值等對縫隙連接作用的影響，并監(jiān)測環(huán)境**和**在*******中所起到的作用。選定經熒光染色后的細胞，借助于光漂白作用或光損傷作用使細胞部分或整體不發(fā)熒光，實時觀察檢測熒光的恢復過程，可直接反映細胞胞間通信結果。
    細胞膜的流動性在進行膜的磷脂酸組成分析，**作用點和**作用效應，測定溫度反應和物種比較方面有重要作用。細胞膜熒光探針受到極化光線激發(fā)后，發(fā)射光極性依賴于熒光分子的旋轉，這種有序的運動自由度取決于熒光分子周圍的膜流動性，所以極性測量能間接反映細胞膜的流動性。
    綜上所述，激光掃描共焦顯微鏡由于其高分辨率、高靈敏度、高放大率等特點，在細胞水平上可作多種功能測量和分析，成為分析細胞學的一項重要研究手段。隨著LSCM設備和應用技術的不斷完善，它在生物醫(yī)學和生命科學領域里將起到更重要的作用。